abril 2015 Archivos


Curso: “MÉTODOS AVANZADOS DE ALERGOLOGÍA EXPERIMENTAL”

11na edición, 2015, del 20 al 30 de abril

Extensión y horarios:

Duración: 70 h (36h de conferencias, 34h de prácticas demostrativas)

De lunes a viernes de 8:30 am a 5:30 pm. (horario de almuerzo: 1:30-2:30 pm)

Sede:

Dpto de Alergenos, BIOCEN, Bejucal, Mayabeque, Cuba.

BIOCEN se encuentra 30 km al sur del centro de la ciudad de La Habana, aproximadamente 10 km al sur del Aeropuerto Internacional “José Martí”

Objetivo:

Dirigido a Médicos Especialistas o Residentes de las especialidades de Alergia e Inmunología y otros médicos y profesionales vinculados a las enfermedades alérgicas. Aborda los conocimientos y métodos experimentales más actuales, incluyendo métodos de laboratorio y de investigación clínica, con énfasis en técnicas inmunológicas aplicadas a la caracterización de alergenos, las vacunas de alergenos, al diagnóstico específico de la alergia, al estudio de la respuesta inmunitaria alérgica y la  inmunoterapia alergeno-específica. El curso  promueve una visión científica y actualizada sobre el empleo de la inmunoterapia y se adentra en aspectos metodológicos de los ensayos clínicos en este tema

Participantes: 10 alumnos

Temas:

Biología de los alergenos Profesores
1.    Alergenos de ácaros. Características bioquímicas y alergénicas DrC Alexis Labrada
2.    Biología molecular de los alergenos. Actividad biológica y alergenicidad DrC Alexis Labrada
3.    Reactividad cruzada entre alergenos MSc Bárbara Fernández
4.    Ecología del polvo doméstico MSc. Bárbara Fernández
5.    Sistemática de los ácaros del polvo doméstico. MSc. Bárbara Fernández
6.    Alergenos de alimentos MSc. Maytee Mateo
7.    Práctica: Identificación, aislamiento y cultivo de ácaros alergénicos. MSc Bárbara Fernández
Vacunas y extractos alergénicos
8.    Vacunas de Alergenos: perspectiva histórica DrC Alexis Labrada
9.    Introducción a la tecnología farmacéutica de fabricación de vacunas de alergenos. DrC Alexis Labrada
10.  Métodos de estandarización de productos alergénicos. DrC Alexis Labrada
11.  Aspectos regulatorios para productos alergénicos. Registro sanitario. 2h DrC Alexis Labrada
12.  Manejo aséptico de productos estériles y preparaciones oficinales o dispensariales. MSc Arelis Más
13.  Estabilidad de los alergenos. MSc Arelis Más
14.  Formulaciones para extractos alergénicos. Vías inyectable y sublingual. MSc Arelis Más
15.  Práctica: Determinación de la composición de proteínas en extractos alergénicos (SDS-PAGE) MSc. Arelis Más, Téc. Raisa Cruz
16.  Práctica: ELISA de inhibición de IgE (determinación de potencia alergénica in-vitro) MSc. Wendy Ramírez, Lic. Yunia Oliva
17.  Práctica: Preparación de diluciones de las vacunas VALERGEN para inmunoterapia. Lic. Yunia Oliva, Lic. Damaris Torralba
Elementos de Biotecnología aplicados a la Alergología
18.  Introducción a la tecnología del ADN recombinante. DrC Alexis Labrada
19.  Herramientas bioinformáticas básicas en Alergia, 2h DrC Alexis Labrada
20.  Introducción a la tecnología de los anticuerpos monoclonales y aplicaciones en alergia MSc Wendy Ramírez
21.  Introducción a los ensayos inmunoenzimáticos. Lic. Roxana Samalea
22.  Práctica: Determinación de alergenos de ácaros mediante ELISA con anticuerpos monoclonales. MSc Bárbara Fernández, Téc. Bárbara Luis
Diagnóstico alergeno-específico
23.  Conceptos básicos del diagnóstico específico de las enfermedades alérgicas. Sensibilidad y Especificidad. Dr. Raúl L. Castro
24.  Métodos de diagnóstico in-vivo. Diseño de Ensayos Clínicos de extractos alergénicos para diagnóstico. Dr. Raúl L. Castro
25.  Métodos de diagnóstico in-vitro. IgE específica. DrC. Alexis Labrada
26.  Evaluación de la respuesta inmunológica celular. MSc. Wendy Ramírez
27.  Práctica: ELISA para IgE específica. MSc. Mayteé Mateo; Lic. Yunia Oliva
28.  Práctica: Western Blotting IgE. MSc. Arelis Más, Téc Raysa Cruz
29.  Práctica: Punción cutánea cuantitativa. Dr. Raúl L. Castro, Lic. Yunia Oliva y Lic. Damaris Torralba
Inmunoterapia e Inmunología de las enfermedades alérgicas
30.  Inmunorregulación de las enfermedades alérgicas. Mecanismos de la inmunoterapia alergeno específica. Dra. Mary Carmen Reyes
31.  Immunidad innata y presentación antígénica. Papel en la respuesta alérgica Dra. Mary Carmen Reyes
32.  Avances en la comprensión de la respuesta IgE: implicaciones para la reactividad cruzada y la inmunoterapia. DrC Alexis Labrada
33.  Eficacia y seguridad de la Inmunoterapia. Pautas de inmunoterapia. Dr. Raúl L. Castro
34.  Inmunoterapia por vías alternativas. IT sublingual. Dr. Raúl L. Castro
35.   Variables de eficacia clínica en ensayos clínicos de IT Dr. Raul L. Castro
36.  Reacciones adversas a la inmunoterapia. Clasificación y Reporte MSc. Maytee Mateo
37.  Metodología de Ensayos Clínicos de Inmunoterapia. Dra. Mary Carmen Reyes
38.  Introducción al diseño experimental y la metodología de la investigación en alergología DrC. Alexis Labrada
39.  Vacunas de alergenos de nueva generación. Adyuvantes. DrC. Alexis Labrada
40.  Modelos animales de enfermedades alérgicas. MSc. Wendy Ramírez

Profesores:

1-    Alexis Labrada Rosado, Dr en Ciencias de la Salud, Investigador Titular, Jefe de Dpto de Alergenos

2-    Raúl Lázaro Castro, Dr Med., Especialista II grado en Alergia, MSc en enfermedades infecciosas, Profesor Auxiliar

3-    Wendy Ramírez, MSc Bioquímica, Biotecnóloga

4-    Bárbara Fernández, Lic. Microbiología, MSc Ecología (Acárologa), Biotecnóloga

5-    Mary Carmen Reyes. Dr Med., Especialista I grado en Inmunología

6-    Arelis Más, Máster en Ciencias Farmacéuticas

7-    Maytee Mateo, MSc en Biotecnología

El consumo de vacunas terapéuticas VALERGEN se incrementó en 2014 a 33 733 bulbos que equivalen a cerca de 17 000 tratamientos de inmunoterapia a pacientes alérgicos asmáticos. Desde su inclusión en el cuadro básico de medicamentos de Cuba en 2008, se han administrado un estimado de 70 000 tratamientos, cifra que representa cerca del 7% de los asmáticos del país. Las vacunas VALERGEN, desarrolladas y producidas por BIOCEN, se derivan de componentes alergénicos de tres especies de ácaros del polvo doméstico: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides siboney y Blomia tropicalis; estas dos últimas especies propias de países tropicales. La vía de administración por gotas sublinguales ha ganado en difusión y  en 2014 constituyó el 31% del total de tratamientos. Las ventajas de la vía sublingual se hacen evidentes atendiendo a una reducción considerable de la frecuencia de reacciones adversas y de su severidad. La vía sublingual puede ser administrada por el propio paciente en su hogar y requiere menos supervisión médica especializada. La inmunoterapia con alergenos es reconocida internacionalmente como un enfoque terapéutico capaz de reducir el consumo de medicamentos antialérgicos, elevar la calidad de vida del paciente asmático y prevenir el agravamiento de la enfermedad. En particular, el uso masivo en un sistema de salud pública y gratuita de la inmunoterapia con alergenos y sobre todo con especies tropicales es único en el mundo. Para 2015, el plan prevé elevar la producción y distribución de estos productos a algo más de 40 000 bulbos y continuar la extensión de esta modalidad de tratamiento etiológico en los pacientes asmáticos, contribuyendo así a controlar esta enfermedad crónica de alta prevalencia mundial.

The draft genome, transcriptome, and microbiome of Dermatophagoides farinae reveal a broad spectrum of dust mite allergens. Chan TF et al. J Allergy Clin Immunol 2015 Feb;135(2):539-48. (texto completo libre)

d-farinaeMientras que el término “genoma” ya es de dominio popular, el de “transcriptoma” está menos difundido. Se refiere  al conjunto de “transcripciones” del ADN genómico a ARN mensajero; o sea, equivale al número de proteínas en vías de síntesis (“expresadas”, dicho en lenguaje de la biología molecular) en un organismo o tejido en el momento estudiado. Por su parte “microbioma” denomina  al conjunto de genomas microbianos co-habitantes del organismo hospedero, habitualmente como microbiota normal del tracto digestivo.

El presente artículo constituye un hito importante en la alergología experimental al publicar por primera vez una versión preliminar del genoma (acompañado de transcriptoma  y microbioma) de una de las principales fuentes alergénicas mundiales: el ácaro del polvo doméstico Dermatophagoides farinae. La publicación del genoma permite tener una visión abarcadora de la totalidad de las proteínas potencialmente alergénicas provenientes de este arácnido y evaluar así sus similitudes y diferencias con otras especies. También predecir la existencia de posibles proteínas alergénicas no identificadas anteriormente, por homología con alergenos conocidos. En total, los autores identificaron 16 376 genes y 9 142 transcripciones a ARNm, correspondientes a igual número de unidades polipeptídicas.

El estudio confirmó la presencia de 20 genes (con sus respectivas transcripciones) de alergenos conocidos anteriormente: desde Der f 1 hasta Der f 23, excepto Der f 17 (que aunque ha sido reportado en bases de datos, no se conoce su secuencia de ADN, de modo que su existencia o identidad parece dudosa), así como, los grupos 12 y 19 que hasta ahora parecen exclusivos de Blomia tropicalis. Otros 7 alergenos llamados “no canónicos” se corresponden a secuencias “ortólogas” que en otras especies bastante alejadas taxonómicamente han demostrado generar proteínas alergénicas, tales como profilina (un conocido pan-alergeno hasta ahora encontrado en plantas), Alt a 6 (del hongo Alternaria alternata), Mala s 6 (del hongo Malasezzia simpodialis causante de eccema atópico, dermatitis ganulomatosa y pitiriasis versicolor en humanos) y otros.

Otro de los aportes importantes del trabajo se refiere a la identificación de un nuevo alergeno mayor: denominado Der f 24. Es una proteína de unión a Ubiquinol-Citocromo-C reductasa, la cual juega un papel crítico en la generación de adenosín trifosfato (ATP) e interviene en la llamada respiración celular que consiste en el conjunto de reacciones bioquímicas por las cuales determinados compuestos orgánicos son degradados completamente proporcionando energía aprovechable por la célula, principalmente en forma de ATP. Estructuralmente, es una lipoproteína multimérica transmembrana de 14.45 kDa. Además de su identificación genómica, la proteína recombinante pudo ser expresada en E. Coli y mostró reactividad in-vitro con la IgE sérica de 22 pacientes alérgicos y pruebas cutáneas positivas en 5 de 10 pacientes positivos al extracto de D. farinae.

Al ácaro del polvo doméstico se le ha llamado en ocasiones “ácaro ciego” por la falta aparente de órganos oculares. No obstante, se conoce desde 1975, por evidencias experimentales (Furumizo y Warton[1]) que estos ácaros son capaces de sensar la luz en el rango de longitudes de onda entre 500 y 575 nm (luz verde) y probablemente entre 600 y 675 nm (rojo-naranja); sin haberse podido precisar, sin embargo, la localización anatómica de sus fotorreceptores. El presente estudio arroja más luz sobre los ácaros “ciegos” al detectarse la presencia en los mismos de los genes de la llamada vía de  fototransducción, similar a otros invertebrados, e incluso la expresión de una proteína similar a la Rodopsina, lo cual provee una evidencia molecular importante del proceso de fotodetección en el rango de 500 a 575 nm.

Quizá el aporte más trascendente del trabajo se refiere a la caracterización completa del microbioma del ácaro, identificando un amplio espectro de microorganismos que incluyó más de 100 especies diferentes. El género predominante ampliamente fue Enterobacter con 63.4% del total. El hallazgo contrasta con un estudio anterior que había vislumbrado la presencia de ADN del género intracelular Bartonella.[2] En este estudio las mismas solo representaron 1.7 %. Las enterobacterias son contaminantes frecuentes del ambiente y son reportadas en cerca del 10 % de las infecciones nosocomiales del tracto respiratorio, en particular, la especie E. cloacae, que aquí resultó también predominante. En el trabajo se logra identificar la distribución de este microorganismo a todo lo largo del tracto digestivo del ácaro, con la ayuda de un anticuerpo monoclonal marcado. Entonces, los ácaros pueden servir como un hospedero intermediario para las enterobacterias y contribuir a su transmisión por vía respiratoria, ya que las partículas fecales, por su tamaño y características físicas son inhalables. De ese modo, se provee una posible conexión adicional entre las infecciones del tracto respiratorio y la aparición y desarrollo de la enfermedad alérgica, eventos, cuya asociación es muy conocida de la experiencia clínica y la evidencia epidemiológica.

La localización de estos microorganismos enel tracto digestivo y su capacidad de síntesis de aminoácidos y tiamina sugieren la existencia de relaciones endosimbióticas entre el ácaro y su microbioma, como es bastante común en el reino animal. Una evidencia en ese sentido es el hecho experimental relatado en el trabajo de que los ácaros no son capaces de sobrevivir ante la adición de ampicilina al medio de cultivo, antibiótico capaz de eliminar o reducir drásticamente su microbiota. En esa misma dirección, se identificó en el genoma del ácaro una enzima bacteriolítica digestiva.

Dentro del microbioma, de 20 a 30 genes codifican enzimas involucradas en la biosíntesis de LPS, componente de las membranas de bacterias Gran-negativas. Este hallazgo concuerda con la presencia conocida de endotoxinas en los extractos alergénicos de ácaros, actualmente presentes en el mercado, y empleados para la inmunoterapia alergeno específica. Hasta el momento el origen de estas endotoxinas había sido incierto. El papel del LPS es controvertido, pues es un inmunomodulador pro Th1, capaz, en cierta forma de prevenir la respuesta alérgica IgE en edades tempranas. Sin embargo, la interacción del LPS con las mucosas respiratorias pulmonares promueve la inflamación y el desarrollo del asma. Particularmente, ha sido bien identificada la interacción entre el alergeno mayor Der p 2 o Der f 2 y el LPS, amplificando la respuesta inflamatoria local, mediante mecanismos de la inmunidad innata, activando el receptor TLR4 y la vía Th17. Dilucidar el papel del LPS en los extractos alergénicos pudiera ser importante para lograr una mejor comprensión de los mecanismos de acción de la inmunoterapia alergeno específica. Resulta también intrigante que en contraste con la amplia alergenicidad de las proteínas propias del ácaro, ninguna de las proteínas bacterianas mostró actividad de unión de IgE.

En conclusión, este estudio significa un avance importante en la caracterización de los alergenos de ácaros, con la aplicación de las modernas herramientas biotecnológicas, y posiblemente en la comprensión integral de la etiología de la enfermedad alérgica respiratoria. Sus resultados son de evidente utilidad en el desarrollo futuro de medios de diagnósticos y vacunas terapéuticas.

Referencias


[1] Furumizo RT and Wharton GM (1975) A case of postimaginal moult in the American house dust mite Dermatophagoides farinae Hughes 1961 (Acari: Proglyphidae). Acarologia, 17, 730-733.

[2] Valerio CR, Murray P,  Arlian LG, Slater JE. Bacterial 16S ribosomal DNA in house dust mite cultures J Allergy Clin Immunol 2005;116(6):1296-1300

Por DrC Alexis Labrada