Vibrio cholerae No-01 toxigénico

MÉTODOS

Durante los años 1990 hasta 1996 se recibieron en el Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades Diarreicas Agudas (EDA) un total de 385 cepas de Vibrio cholerae No-01 aisladas de heces de niños menores de 5 años con EDA y procedentes de 7 diferentes centros provinciales de Higiene y Epidemiología (Guantánamo, Las Tunas, Camagüey, Santiago de Cuba, Ciudad de La Habana, Holguín y Granma) del país, de las cuales se escogieron 100 cepas al azar para la presente investigación.

Todas las cepas fueron serotipadas y biotipadas según el método de Sakazaki y otros.⁶ Ellos incluyeron reacción positiva para la oxidasa, crecimiento en diferentes concentraciones de NaCl (0, 3, 6, 7 y 10 %) en caldo triptona, caldo base para la utilización de glucosa, sacarosa, manosa, manitol, inositol, estudio de movilidad, producción de indol, así como la lisina y ornitina decarboxilasa, arginina dehidrolasa y detección de sulfuro de hidrógeno en agar hierro y 2 azúcares de kligler.

A todas las cepas se les investigó la actividad hemolítica por medio de eritrocitos de carnero, la susceptibilidad a polimixin B y la aglutinación con el antisuero polivalente de Vibrio cholerae 01, así como con los monovalentes Ogawa e Inaba.⁶ La susceptibilidad antimicrobiana frente a 18 drogas fue determinada por la técnica de Bauer-Kirby.⁷ La presencia de toxina termoestable se investigó mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), con la utilización de 2 oligonucleótidos o cebadores de 21 y 23 pares de base, los cuales fueron diseñados sobre la secuencia del gen conocido, con amplificación de una región de 238 pares de base.⁸ La confirmación de un resultado positivo mediante RCP fue realizada con la aplicación de la técnica de hibridación ADN/ADN, y mediante la utilización como sonda del fragmento de ADN que codifica para la toxina termoestable, insertado en el sitio SmaI del plásmido p Bluescript-SK+/-, portado por una cepa de E. coli K12.⁹

La expresión biológica de la toxina fue investigada mediante la prueba de inoculación intragástrica en ratón lactante.¹⁰ Se utilizaron las cepas de Vibrio cholerae No-01 (CO32 productora de NAG-ST como control positivo y la cepa de E. coli K99 como control negativo.