Obtención y caracterización de cepas atenuadas de Vibrio cholerae O139 para identificar ingrediente farmacéutico activo de una vacuna contra el cólera
Autor: DrC. Talena Yamilé Ledón Pérez (2013)
Doctor en Ciencias Biológicas, Centro Nacional de Investigaciones Científicas.
Tesis de doctorado archivada en el repositorio de tesis de la BVS Cuba
Acceda a ella EN: http://tesis.repo.sld.cu/520/1/DiazJidy.pdf
Resumen
El cólera causado por Vibrio cholerae de serogrupo O139 coexiste en Asia con el causado por vibriones de serogrupo O1. Aunque existen dos vacunas comerciales 60 % eficaces contra el serogrupo O1, no existe ninguna con eficacia probada contra el cólera causado por vibriones del serogrupo O139. Se acepta que Vibrio cholerae de serogrupo O139 constituya el agente causal de la octava pandemia de cólera; por esta razón en este trabajo se seleccionó el aislado clínico CRC266 como progenitor para la construcción de cepas atenuadas genéticamente, las que pudieran constituir el ingrediente activo de una vacuna viva contra el cólera causado por vibriones del serogrupo O139. Al caracterizar la organización genética de los profagos CTXφ en CRC266, se identificó que en el locus dif del cromosoma 1 de esta cepa coexisten copias de CTXφ intactas con copias carentes de los genes de la toxina colérica, conocidas como precursores de CTXφ (pre-CTXφ).Como novedad se describe una diversidad alélica en pre-CTXφ que permite replantear el modelo explicativo de la relación evolutiva entre estas formas atoxigénicas y las variantes conocidas de CTXφ (Clásico, El Tor y Calcuta), asumiendo que diferentes variantes precursoras han adquirido independientemente los genes de la toxina del cólera, para dar lugar a las variantes toxigénicas actuales. Luego la cepa CRC266 se modificó genéticamente mediante la supresión de los profagos CTXφ y pre-CTXφ del genoma y se obtuvieron las cepas TLP3, TLP11 y TLP13. Mediante remplazo alélico el gen hapA de TLP13, codificante de la proteasa soluble principal de Vibrio cholerae hemaglutinina/proteasa), se sustituyó por un alelo interrumpido por el gen celA de Clostridium thermocellum que codifica la endoglucanasa A. En consecuencia, las cepas obtenidas TLP131, TLP132 y TLP134 se distinguen de otros vibriones mediante un ensayo bioquímico sencillo y rápido. Finalmente, a TLP132 se le suprimió el gen mshA y se obtuvo TLP01, TLP03 y TLP05 que no expresan la fimbria conocida como hemaglutinina sensible a manosa (MSHA). Estas cepas colonizan el intestino del ratón Balb/c lactante sin provocar efecto letal y no se infectan con el fago VGJφ debido a la ausencia del receptor MSHA, por lo cual no readquieren los genes que codifican la toxina colérica mediante la infección y lisogenización con un fago híbrido de CTXφ y VGJφ. Las cepas TLP01 y TLP05, no forman biopelículas sobre superficies abióticas en cultivo de laboratorio, característica que limitaría la supervivencia en el entorno natural y actuaría como elemento de contención del agente biológico que constituya el ingrediente activo del candidato vacunal. Estas cepas resultaron inductoras de títulos de anticuerpos con actividad bactericida en el conejo y la rata adultos, por lo que se concluye que las cepas TLP01 y TLP05 reúnen las características necesarias para transitar hacia la fase de desarrollo farmacéutico para posterior evaluación preclínica y clínica de seguridad e inmunogenicidad.
